生物技术和非生物胁迫

植物和微生物基因组学的最新进展提供了新的和令人兴奋的分子工具，使科学家能够剖析耐胁迫或抗胁迫的生化和分子机制。这些信息可以用来开发免受非生物胁迫影响的新作物植物。由于许多这些主要的非生物胁迫是由一种常见的生化现象引起的，因此努力提高对其中一种的耐受性

图20.1。不同环境胁迫对植物的反应或适应机制及关键过程的影响

非生物胁迫具有使人耐受其他非生物胁迫的潜力。最近，新的科学研究集中在用抗胁迫基因修饰高等植物上。这些努力证明了增强的非生物胁迫耐受性干旱、盐度、温度、氧化、pH、重金属和水淹胁迫，也为通过生物技术增强作物非生物胁迫耐受性的概念提供了验证。

20.2.1盐度和耐旱性

干旱和盐碱化是主要和最普遍的环境压力，极大地限制了非灌溉和灌溉农业的作物生产力(Epstein et al.， 1980)。为增加作物产量而采用的灌溉管理措施加剧了盐碱化对农业的不利影响。盐度、干旱或温度导致的细胞水分亏缺会导致细胞体积的变化，包括膨压损失、溶质浓度、离子位移、膜结构和完整性以及蛋白质变性，以及各种细胞过程的改变(Bray, 1997)。由于这些非生物胁迫对经济的巨大影响，许多最初的生物技术研究集中在干旱和耐盐性上。最近的代谢工程报告表明，低分子量渗透保护剂以糖(果聚糖)、多羟基糖醇(多元醇)、氨基酸(脯氨酸)和四元胺(甜菜碱)的形式积累，为植物的渗透保护和渗透调节提供了机制。

Pilon-Smits等人(1995)证明，通过改造烟草植物，使其产生更高的果聚糖水平，可以提高烟草植物的耐旱性。在缺水条件下，与野生型对照植物相比，经sacB基因改造的烟草(nictiana tabacum)植株的生长速度提高了55%，生物量产量提高了59%。sacB基因编码一种靶向植物液泡的果糖基转移酶。研究人员得出结论，将果聚糖引入非果聚糖生产物种将潜在地增强对干旱胁迫的抗性。

海藻糖是一种非还原性双糖，被认为是一种能够抵御完全脱水的植物保护作用的成分(drerennan et al.， 1993)。在转基因烟草中引入酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因，在转基因烟草中实现了海藻糖的过量生产二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子(Holstrom et al.， 1996)。产生海藻糖的植物在发育的各个阶段都表现出较高的保水能力和耐旱性，尽管海藻糖的细胞水平很低(细胞质中为0.5 mM)。

许多光合生物在渗透胁迫下自然积累脯氨酸。脯氨酸的积累被认为是氧化还原库、自由基清除剂、pH稳定剂和保护性溶质，为细胞提供耐旱和耐盐性(Kishor et al.， 1995)。d1 -吡咯-5-羧酸合酶(一种双功能酶，催化谷氨酸转化为a1 -吡咯-5-羧酸，脯氨酸的直接前体)的樟豆结构基因已被引入烟草(Kishor et al.， 1995)。在干旱胁迫下，转基因植株产生的脯氨酸多10- 18倍，并且在叶液中表现出相对较高的渗透势。此外，在盐胁迫条件下，脯氨酸过量植株的生物量和花的发育都有所提高。

已在拟南芥(Thomas et al.， 1995)和烟草(Tarczynski et al.， 1993)中证明了在高等植物中工程生产渗透保护剂甘露醇的能力。过表达编码甘露醇1-磷酸脱氢酶的细菌mltd基因的拟南芥种子在盐浓度升高时萌发率提高。同样，表达mltd基因的烟草植株产生的甘露醇最大浓度为100 mM，这导致在高盐条件下相对于对照增加了生物量产量。

Vernon等人(1993)利用烟草中编码肌糖醇o-甲基转移酶的lmt1基因表达产生环糖醇(环糖醇，如壬糖醇)过剩作为模型系统，测试环糖醇过剩在赋予渗透胁迫耐受性方面的作用。然而，在这些转基因植物中，没有确凿的证据表明环醇的过量生产与胁迫耐受性有关。

Saneko等人(1995)证明，含有甜菜碱的玉米(Zea mays L.)品系对盐度胁迫的敏感性低于缺乏甜菜碱生产的突变体，从而为这种渗透剂的保护潜力提供了证据。Lullis等人(1996)通过将编码胆碱脱氢酶的大肠杆菌β基因引入烟草，证明转基因植物具有更高的耐盐性。通过干重积累测定，表达betA基因的烟草植株表现出增加的甜菜碱产量，导致耐盐性比野生型植物增加80%。通过过表达细菌胆碱氧化酶codA基因，在拟南芥中也取得了类似的结果(Hayashi et al.， 1997)。过表达codA的拟南芥也表现出了对冷胁迫的耐受性，在高盐条件下表现出了稳定的光系统II和正常的萌发。

除了小分子在植物抗逆性中发挥作用外，一系列被称为胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)的蛋白质，首次在经历干燥的植物胚胎中发现，已被认为在抗逆性中发挥作用。在水稻肌动蛋白启动子调控下，从大麦(Hordeum vulgare L.)中提取的LEA蛋白基因HVA1导入水稻(Oryza sativa L.) (Xu et al.， 1996)。转基因HVA1水稻植株对水分亏缺和盐胁迫的耐受性显著提高。耐受性的增加表现为压力下生长速度的增加，损伤症状的延迟发展，以及压力消除后恢复的改善。

尽管上述效应子增加植物耐水亏的能力已经得到证实，但其中一些单一效应子可能并不完全足以赋予广泛的植物大量的耐胁迫能力。以协调的方式控制几个效应器的能力可能需要达到一致的抗应力能力。为此，最近的工程研究主要集中在调节信号转导级联和转录调节因子，作为改变植物内源性胁迫应对机制的手段。Pardo等人(1998)证实，在转基因烟草植株中，过表达一种截断形式的钙调神经磷酸酶(CaN，一种Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶，参与酵母中的盐胁迫信号转导)介导了盐适应。改良植株根系生长受到的干扰较小，茎部成活率较高。植物对can转基因的耐受性在分离群体中增加，这证明了酵母和植物之间存在一个共同的信号通路，并且外源蛋白能够调节胁迫耐受性。

利用甜瓜品种(Cucumis melo)表达酵母耐盐基因HAL1(一种编码调节单价离子通道的水溶性蛋白质的基因)的基因工程研究表明，将转基因甜瓜植物置于高盐条件下会减少根和营养的生长。含有该性状的植物始终比没有该性状的对照植物具有更高的耐受性(Bordas et al.， 1997)。

20.2.2温度应力

植物在极端高温和低温下生存的能力差异很大。决定植物生存或适应极端温度的能力的因素只被部分了解，但改变作物植物以抵御极端温度的必要性是显而易见的。随着气候模式因人类的影响而改变，开发在更广泛的地理和环境中发挥作用的作物物种将变得越来越重要温度范围．

低温是限制植物生长的主要环境胁迫之一。认识的重大进展耐寒性利用生物技术改变植物的冷敏感性。质体膜脂肪酸去饱和的增加与植物耐寒性的增加有关(Steponkus et al.， 1993)。人们通过改变植物的脂肪酸组成来改变其耐寒性。对过度表达拟南芥w-3脂肪酸去饱和酶(Fad7)基因的转基因烟草进行了耐寒性改变分析(Kodama et al.， 1994)。当在1°C的温度下暴露7天，然后恢复到最佳温度时，转基因Fad7植物没有表现出野生型对照所表现出的生长抑制和褪绿现象。因此，转基因改变似乎保护了烟草免受冷害。fad7基因的过表达提高了抗寒性。

Ishizaki-Nishizawa等人(1996)将来自无囊藻(Anacystis nidulans)的广泛特异性d9 -去饱和酶基因(Des9)与植物叶绿体靶向序列融合，并引入烟草。他们证明了转基因植物中d9单饱和脂肪酸增加了17倍。当这些植物暴露在1°C下11天，它们没有显示出黄化的迹象。这表明，d9 -单饱和脂肪酸含量增加的植物免受低温伤害。

由于冰冻温度会改变细胞的水分平衡，通常表现出耐旱或耐盐的植物也能耐受冰点以下的温度。抗旱性和耐盐性增强的转基因植物，显然是由于低分子量渗透压剂数量的增加，也增加了低磷耐温性．过表达codA基因的拟南芥表现出较高水平的甘氨酸-甜菜碱，并被证明具有更好的耐盐性和增强的耐寒性(Hayashi et al.， 1997)。当将胆碱脱氢酶的细菌β基因引入马铃薯(Solanum tuberosum L.)时，可以得到一种新的胆碱脱氢酶基因耐寒性观察表型(Holmberg和Bulow, 1998)。

在冷驯化植物中诱导的许多基因编码功能不确定的亲水蛋白(COR蛋白)，这些raybet雷竞技最新被认为在耐寒性中起着关键作用(Thomashow, 1998)。表达其中一种COR蛋白(COR15am)的转基因拟南芥构成性表明叶绿体比非转基因对照质体耐受性高1-2°C (Artus et al.， 1996)。

冰的形成植物细胞中的晶体暴露在短暂的冷冻温度下会导致机械破坏，杀死细胞，并影响作物产量和收获的产品质量。许多抗冻植物含有抗冻蛋白，可以降低细胞结冰形成的温度(Thomashow, 1998)。极地鱼类血液中的抗冻蛋白已被证明可以抑制冰成核。Hightower等人(1991)证明，将编码鱼类防冻蛋白(AFP)的基因引入烟草可以抑制结冰再结晶在转基因组织中。虽然在这些转基因植物中没有明确的抗冻性，但这些实验为使用AFPs赋予植物抗冻性提供了一些验证。

在工厂的耐高温工程上投入的精力要少于低温工程。通常，育种家和生理学家在评估田间产量稳定性和作物性能时，会将热胁迫与干旱胁迫联系起来。人们认为高温应力对人体有影响植物生长发育发生在光合作用和开花、授粉、结实子等生殖过程中。植物细胞通过快速积累热休克蛋白(HSPs)来应对热胁迫。虽然只有相关的证据表明热休克蛋白可以保护细胞免受高温胁迫，但通过过表达热休克蛋白融合来改变植物耐热性的尝试已经取得了一定的成功。Lee et al.(1995)和hindhofer et al.(1998)研究表明，将HSP-reporter融合基因导入植物可以提高拟南芥的基础耐热性。

Jaglo-Ottosen等人(1998)通过组成式表达拟南芥低温转录激活蛋白CBF-1，证明了转基因拟南芥抗冻性的能力。通过修改该蛋白的表达，研究人员证明，在没有驯化期的情况下，可以重新定向植物的遗传资源，使其具有耐寒性。这为通过工程植物信号和调控途径来改变耐热性和其他胁迫反应的能力提供了依据。

20.2.3重金属应力

在过去的十年中，现代农业实践，如使用污水污泥，已导致耕地土壤受到重金属污染。此外，采矿和冶炼作业产生的径流使大片土地受到铜(Cu)和锌(Zn)的污染(Petalino和Collins, 1984)。铝(Al)是地壳中最常见的金属(主要以不溶性铝硅酸盐的形式存在)。在pH值为5.5或更低的酸性土壤中，铝以溶解形式(主要为Al3+)存在时，对许多作物植物具有毒性，目前被认为是全球40%耕地土壤上作物产量和生产力的主要障碍(Ryan et Al .， 1995)。土壤酸化在一定程度上加速农业实践与酸雨的发生有关。为了保持受这些污染物水平增加不利影响的土壤的生产力，需要持续施用石灰。这种补救措施本身可能造成径流污染，从而产生额外的水质问题。受污染土壤的水平和面积不断增加，要求发展能够在重金属存在下生长的作物植物，并将重金属封存在非食用植物部位。这必须通过传统育种或基因工程来实现。

铝毒性对植物的主要作用是抑制根系生长。这会导致营养缺乏和生长减少，从而对作物产量产生负面影响(Ryan et al.， 1995)。一些耐铝植物被假定利用的一种机制是释放有机酸，如柠檬酸，它在细胞质膜外与铝螯合，从而阻止其摄取(Miyasaka et Al .， 1991)。De la Fuente等人(1997)证明，转基因烟草和番木瓜(Carica papaya L.)植物经工程改造后可以过量生产柠檬酸盐，从而对大量铝产生耐受性。烟草和番木瓜植物经工程改造后，在组成启动子的调控下编码柠檬酸合成酶(CSb)的细菌基因。在300 ||M Al浓度下，表达CSb基因的植物根系中柠檬酸含量提高了10倍，根系生长得到了促进，而对照组在50 ||M浓度下表现出严重的抑制。

另一种解决重金属耐受性的方法是在植物内结合和隔离重金属，以防止其毒性作用，从而赋予重金属抗性。一些研究人员利用这种方法，利用低分子量金属结合蛋白(金属硫蛋白)改造植物。金属硫蛋白(MTs)在哺乳动物和真菌中被发现，在这些系统中具有解毒重金属的功能。转基因芸苔和烟草植物已经被创造出来，它们构成了一种哺乳动物MT-II基因(Misra和Gedamu, 1989)。带有这些结构的植物被证明可以在高达100 ||M的镉(Cd)有毒浓度下生长，而对照组表现出严重的根/茎发育迟缓和褪绿症。这种方法也被用于在组成性启动子控制下用小鼠(MT-I)基因改造烟草植物(Pan et al.， 1994)。转基因MT-1烟草植株不受200 mM以下镉浓度的影响，而对照植株在10 ||M时出现褪绿现象。这些早期的实验提供了有希望的证据，证明农作物可以在这些富含重金属的土壤中生长。

20.2.4氧化应激

环境压力的一个常见后果是氧化应激现象。这些氧化事件源于各种细胞反应的中断，产生活性氧，导致细胞氧化损伤。这些氧化应激也可以直接由暴露于臭氧和农药引起。虽然植物系统对于二次氧化应激损伤的保护是复杂的，关键的酶防御是超氧化物歧化酶(SODs) (Bowler et al.， 1992)。在植物中已经发现了三种不同类型的SOD，并根据它们的辅助因子金属进行了分离:(i)细胞质和叶绿体中的铜/锌SOD;(ii)叶绿体中铁超氧化物歧化酶;线粒体中的锰SOD (Bowler et al.， 1994)。一些研究人员报告了烟草和苜蓿(Medicago sativa L.)植物在氧化胁迫下通过过度表达针对植物细胞器的独特SOD基因来改善性能(Van Camp et al.， 1994;Aono等人，1995;斯鲁滕等人，1995;Mckersie等人，1996;Van Camp et al.， 1996)。此外，Aono等人(1995)证明，SOD和谷胱甘肽还原酶基因的组合比单独的任何一个基因都具有更强的抗氧化应激保护作用。

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