NifM的可能函数

最后更新于2022年1月7日星期五|固氮作用

如上所述，肺炎克雷伯菌nifM基因产物与固氮杆菌nifM基因产物同源性很低。然而，在这些蛋白质的羧基末端区域存在一些显著的同源性，这表明所观察到的功能相似性(种间互补)可能仅限于该区域。我们比较了nifM基因的羧基末端区域，并生成了一个一致序列，然后将其与概念翻译的核苷酸序列数据库进行比较。这一比较表明，NifM蛋白的羧基末端区域与称为肽基脯氨酸顺/反式异构酶的蛋白质家族具有显著的同源性(图2)。

肽酰脯氨酸顺/反式异构酶(PPIases)被认为参与协助蛋白质折叠(Fisher, 1994)。这些蛋白质催化寡肽和蛋白质中肽基-脯氨酸肽键的顺式/反式异构化-蛋白质折叠过程中的一个速率限制步骤，对产生功能蛋白质至关重要。一些变性蛋白质在几毫秒到几秒内就能恢复到原来的构象;然而，其他的折叠非常缓慢，时间范围从几分钟到几小时不等。缓慢的构象变化源于酰胺键中众所周知的电子失效，如果脯氨酸环施加了额外的空间约束，则构象变化会更加明显。与C(0)NH键相反，脯氨酸-肽键存在于两种最低能量构象形式-顺式(w = 0°)和反式(w = 180°)-这两种构象形式在热力学上具有可比性。因此，含有n个脯氨酸残基的多肽可以以2”异构体形式存在(图3)。当蛋白质形成三维结构时，顺式和反式

这些结构中的异构体不再具有相等的能量，较不受欢迎的异构体不太可能存在于折叠链中。根据脯氨酸假说，假定未折叠蛋白质的慢折叠形式具有脯氨酸和另一残基之间的肽键的非原生异构体，并且慢折叠分子的重折叠中的关键步骤受到这种不正确的脯氨酸-肽键的慢异构化的限制。ppiase已被证明催化这些肽基-脯氨酸键的顺反异构化，从而提高变性蛋白质的慢折叠形式的再折叠速率。

		域1	域2
NifM共识		——h-l-t d——el-r fa - a -	-hs-CD————q-lq
答:vinelandii	NifM	KAHILVTINEDFPELKRLRGK PERFAEQAMKHSECPT-AMQGGLLGEWP
A.chroococcum NifM		ARHILVTINEDFPELKRLRGK PERFAEQAMKHSECPT-AMQGGLLGEWP
k .肺炎	NifM	TRHLLLTVDNDR-ELYRQINASRDAFAPLAQRHSHCPS -ALEEGRLGWISR
B.coli加州公共政策研究院		ALHILVKEEKLALDLLEQIKNGAD-FGKLAKKHSICPS-GKRGGDLGEFRQ
b . subtillis	相识	Ashilvadkktaeevekklkkgek-fedlakeystdss - askggdlgwfak
B.coli SurAn		LSHILIPLPENPTSIVDQARNGAD-FGKLAIAHSADQQ-ALNGGQMGWGRI
大肠杆菌SurAc		ARHILLKPSPIMTDAADIESGKTT-FAAATKEFSQDPVSANQGGDLGWATP
B.subtillis	羊痘疮	IRHIWKDEEEAREVLKELKGGSS -FEAVAAERSTDRYTSPYGGDLGFVTE
L. la PrtM		VQHILTSDEDTAKQVISDLAAGKD-FAMLAKTDSIDTATKDNGGKISFELN
是人类		FQSPASQFSDC-S SAKARGDLGAFSK
D.disc。羊痘疮			GDP !——rqrggdlgwapa
A.thaliana PPIASE		FEEVATRVSDC-S SAKRGGDLGSFGR
		Domain3
共识	——Q-lvP-1	——如果————————cr-h-l-ce
NifM-A。v。	——GTLYPELDACLFQMARGELSP-VLESPIGFHVLYCESVS		(P14890)
NifM-A.c。	——GTLYPELDACLFQMARGELSP-VLESPIGFHVLFCESVS		(P23119)
NifM-K.p。	- gllypqletalfslaenalsl - piaselgwhllwceair		(P08534)
PpiC-E。c。	- - gqmvpafdkwfscpvleptg - plhtqfgyhiikvlyrn		(M87049)
PrsA-B.s。	-EGQMDETFSKAAFKLKTGEVSD-PVKTQYGYHIIKKTEER		(P24327)
SurAn-E.c。	——QELPGIFAQALSTAKKGDIVG-PIRSGVGFHILKVNDLR		(S40574p)
SurAc-E.c。	——difdpafrdaltrlnkgqmsa-pvhs s fgwhlielldtr		(S40574p)
Orf-B.s。	ASDNIPSAYIEEAKTLKEDEWSQEPIKVSNGYAIIQLKEKL		(D26185_135g)
PrtM-L.1。	- nktldatfkdaayklkngd ytqtpvkvtdgyevi km inhp		(Q02473)
是人类	——GQMQKPFEDPWFARRTGEMSG-TVFTDSGIHVIVRTE		(M86110g)
Orf-D.d。	- tnyvqpfaeavtklkkgqlvdk - pvqtqfgwhviqvddtr		(X70280)
PPIASE-A.t。	GQMQKPFEEATYALKVGDISD IVDTDSGVHII		(F13919)

图2。NifM蛋白的一致序列与肽基脯氨酸顺反异构酶的氨基酸序列的比较。具有高同源性的三个域由下划线标识，并被任意编号。每个肽的完全保守残基以粗体显示。

	/ -	- v
R. / -		>
R. / -	o J

图3。一个肽键n端与脯氨酸的顺式和反式异构体结构的差异。

ppiase普遍表达，编码这些蛋白的基因已在植物和动物以及低等真核生物和细菌中被发现(Fisher 1994和其中的参考文献)。这些蛋白质也被称为免疫亲和素，因为它们结合免疫抑制药物，如环孢素，FK506和雷帕霉素。ppiase的两个主要家族被称为环亲素(环孢素结合蛋白)和FKBPs (fk506结合蛋白，也结合雷帕霉素)。这两个科之间的序列相似性很小。然而，在每个家族中都有一些区域含有在进化过程中高度保守的氨基酸。这些高度保守的区域涵盖了约100个环亲素残基和约80个FKBPs残基。在大肠杆菌中，目前已鉴定出两个编码亲环蛋白的基因和两个编码fkbp相关蛋白的基因。除了这些基因，最近从大肠杆菌中分离出一个新的基因，该基因编码一种具有PPIase活性的蛋白质，该蛋白不受环孢素或FK506的抑制。这种蛋白与属于亲环蛋白或FKBP家族的PPIases没有明显的同源性，分子质量非常低，被称为PpiC或Parvulin (Rudd et al. 1995)。然而，将该蛋白与数据库中预测的氨基酸序列进行比较，发现PpiC蛋白与枯草芽孢杆菌脂蛋白PrsA、大肠杆菌蛋白SurA和NifM蛋白之间有三个显著的氨基酸相似性区域(图2)。基于这一比较，有人认为PpiC蛋白和与PpiC具有氨基酸相似性的蛋白质定义了一个新的ppiase家族。

因此，我们的对比研究和其他研究(Rudd et al. 1995)表明，NifM蛋白可能的功能之一是通过肽键n端与该肽中脯氨酸残基的旋反异构化催化构象相互转换，从而协助铁蛋白的正确折叠。通过比较不同的铁蛋白，对铁蛋白的一致肽序列进行检查，确实显示存在7个完全保守的脯氨酸残基(图1)。因此，可以合理地假设蛋白质的稳定性和活性在很大程度上取决于蛋白质中肽基-脯氨酸键的适当构象。为了验证这一想法，我们继续过表达和纯化野生型肺炎克雷伯菌和葡萄球菌NifM蛋白，并分析这些蛋白的PPIase活性。我们的分析使用了用于确定PPIase活性的标准蛋白酶偶联试验(Fisher 1994)，并允许我们评估NifM蛋白催化寡肽中肽基-脯氨酸键的旋反异构化的能力。结果表明，NifM表现出的PPIase活性程度与大肠杆菌的PpiC相当，该PPIase与NifM具有同源性。

为了了解NifM蛋白在改变铁蛋白稳定性和活性方面的作用，我们还利用“MATCHMAKER双杂交”酵母遗传分析研究了NifM蛋白和铁蛋白之间的直接相互作用，如图4所示。我们的初步结果表明铁蛋白之间存在直接相互作用

(翻译融合到GAL4 DNA结合域[GAL4BD])和NifM蛋白(翻译融合到GAL4激活域[GAL4AD])在酵母双杂交蛋白-蛋白相互作用试验中。

共转化'酵母菌菌株Y190

细胞可以合成融合蛋白

激活域

细胞可以合成融合蛋白

: 选择SD色氨酸“leu”介质

NifM-NifH相互作用使G:il4结构域接近pro\iniit>

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图4。通过使用“MATCHMAKER双杂交”酵母遗传分析分析铁蛋白和NifM蛋白之间的相互作用的一般策略。

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图4。通过使用“MATCHMAKER双杂交”酵母遗传分析分析铁蛋白和NifM蛋白之间的相互作用的一般策略。

继续阅读:nif Operon的组织

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