建设一个覆盖Sinorhizobium的微阵列Meliloti1021基因组
s . Ruberg1 b . Linke1 e . Krol1 s Weidner1 U.D. Schiller2, s . Kurtz2 r . Giegerich2
Lehrstuhl皮毛Genetik,德国比勒费尔德大学的同事
2 ag Praktische Informatik科技Fakultat,德国比勒费尔德
共生土壤细菌的基因组的测序meliloti 1021最近完成了由一个国际财团(Galibert et al . 2001年)。基因组包含三个经由:3.5 Mb染色体,1.35 Mb megaplasmid pSymA和1.7 Mb megaplasmid pSymB。基因组序列预测6204年的编码蛋白的基因注释(http://sequence.toulouse.inra.fr/rhime/Consortium/home.html)。构建一个微阵列在玻璃幻灯片以及macroarray尼龙膜组成DNA片段代表6204编码子引物对6163年放大这些羊痘疮的内部碎片通过PCR和41 70 mer寡核苷酸被设计使用Primer-Lib软件(b的左翼,比勒费尔德,未发表),创建一个底漆数据库,允许的设计以及验证引物序列在基因组整体的规模。大部分的引物对扩增300 - 350个基点片段,而剩下的引物对扩增80年至299年英国石油公司代表短基因的片段。所有引物不同的Tm小于1°C。所有的引物携带5 '扩展允许reamplification使用标准的引物PCR的扩增片段。目前,片段的扩增6163种不同meliloti 1021羊痘疮。
Hindlll和BsrGl限制性位点的5 '扩展没有出现在放大6051 orf序列可用于定向克隆到向量pK19mob2HMB可动员的自杀。4992年克隆片段超过220个基点选择允许集成产生的美国meliloti基因通过同源重组质粒。因为内部预测蛋白质编码子片段的选择,在大多数情况下质粒整合将导致基因功能的丧失。目前,这些片段的克隆和接合。
链接器盒183个基点和1498年30-bp标签设计建设的一套miniTnJ每个包含两个转座子标签。链接器盒和标签序列使用DNA序列编译器软件设计(Feldkamp等人http://lsll-www.cs.uni-dortmund.de/molcomp)。所有序列都设计成尽可能不同meliloti 1021基因组序列和相互借鉴。所有标签包含24 bp的Tm变量序列和两侧序列逼近兼容Hin&lll和Kpnl限制性位点变化小于1 1°C。这些标签是合适的转座子的插入到Kpnl和HindUl网站mTn5-GNm-L来源于转座子mTn5-GNm吕富(et al . 1999年)由链接器盒插入Sfil站点。标签序列插入到连接器盒可以放大使用两个标准定量PCR引物对单独或结合使用。标签与结扎后镀膜玻璃表面的氨基改性链接器和变性。进行了杂交使用Cy3 -和Cy5-labeled标记放大从混合物中含有96种不同的标记包含片段在不同的比率。交叉融合实验表明,该标签可以通过杂交分化。突变体进行单独标记的转座子适合这些突变体的混合物的分析竞争实验。
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