隔离和表征Diazotrophic从草内生菌对植物生长的影响
P.J.里格斯,R.L.莫里茨,抗议Chelius, y, A.L. Iniguez,克里Kaeppler,
部门的农艺、威斯康星大学麦迪逊分校、麦迪逊,美国WI 53706 1。介绍
在甘蔗固氮作用的发现diazotrophic内生菌Dobereiner,肯尼迪和同事(评论看到Boddey et al . 2000;塞维利亚,肯尼迪2000)鼓励世界各地的几个实验室确定固氮其他草本植物和细菌之间的关联。在这里,我们审查我们的努力发现这种联系,呈现一些新数据的描述有些关联,并描述我们对未来的计划。
我们首先分离出diazotrophic内生植物从field-grown玉米来自威斯康辛大学实验农场农业在生长季节(杭et al . 1996年)。使用过程的董et al .(1994),当流体从阀杆和收集是镀上修改LGI Cavalcante媒介和Dobereiner (1988)。三个隔离能力的增长在一个摘要介质可以降低乙炔以及15 n2合并到细胞体外。这些隔离标识为克雷伯氏菌属的成员。我们估计,在这些茎细胞的数量大约是2000每克鲜重的组织。这是大约2 - 3数量级的数量低于Gluconacetobacter diazotrophicus甘蔗。自那时以来,我们取得了其他四个独立组织内部的克雷伯氏菌菌株的玉米(Chelius Triplett 2000 a, 2000 b, 2001)。克雷伯氏菌是常见的玉米内生菌。
我们接下来想证明这些克雷伯氏菌内生菌是存在于玉米的内部,他们可以进入植物接种(Chelius Triplett 2000 a)。标签后,克雷伯氏菌细胞持续表达绿色荧光蛋白的基因,细胞被发现进入玉米接种和居住在大量的根皮层细胞间空间。他们存在于茎,但在根的数量远低于。此外,这些克雷伯氏菌会产生NifH蛋白质提供足底,蔗糖添加到植物的营养解决方案(Chelius Triplett 2000 b)。Egener et al。(1998、1999)以前显示的表达由Azoarcus nifH sp.水稻幼苗需要添加碳源。
我们还展示了文化相关的和文化无关的方法,在原核生物的系统发育多样性玉米非常广泛(Chelius Triplett 2000 c, 2001)。几个部门的细菌存在于玉米的最大比例细菌属于变形菌门。古生菌的两个师,euryarchaea crenarchaea,也存在于玉米但是鉴于需要嵌套PCR检测玉米古生菌的存在,我们怀疑他们的数量在足底相比非常低的细菌。非常新颖的细菌也被从内部培养的玉米。这包括一个新的属和物种,Dyadobacter fermentens (Chelius Triplett 2000 c)。
克雷伯氏菌的频率被发现在玉米鼓励我们描述这些内生diazotrophs更彻底。我们特别感兴趣的比较这些内生菌临床分离株的K肺炎。开始这项工作,我们使用基因种间微阵列杂交来识别3000个基因与大肠杆菌是存在于我们的一个内寄生的克雷伯氏菌(董et al . 2001年)。基因存在于我们的内生菌之一,但没有在临床分离的肺炎k被孤立的减法杂交。
除了分离内生菌从玉米,我们也从柳枝稷分离出许多内生菌(黍virgatum l .)。柳枝稷收集残骸草原的威斯康辛州的中部沙漠地区。这些原生植物从未见过氮肥。几个diazotrophs收集的隔离和表征从这些植物将这里描述以及它们对小麦和水稻的生长的影响。
我们发现几个diazotrophic内生菌促进玉米生长的氮肥在温室和田间试验(里格斯et al . 2001年)。一个新颖的方法来发现这些增长将增加的分子基础。
2。过程
2.1。收集和柳枝稷的文化。柳枝稷植物收集布埃纳维斯塔(WS98.1)从采石场草原,草原残余原生珩附近的威斯康辛州在一个极其沙质土壤。从每10个随机植物,我们收集了10个分蘖,核电站周围的土壤样本,样本open-pollinated种子的植物。分蘖是种植在大约200毫升的草原土壤温室里的沙子包围。植物被浇水和- n营养解决方案。
2.2。从柳枝稷和玉米分离内生菌。内生菌分离从玉米和柳枝稷如前所述(Chelius Triplett 2000 a, 2000 b, 2001)。肺炎克雷伯菌342年分离出一个N-efficient国际玉米和小麦改良中心的玉米获得,在墨西哥的国际玉米和小麦改良中心。Pantoea sp。P101和P102隔绝柳枝稷行收集近千鸟,威斯康辛州。
2.3。接种、存在和NifH小麦k .肺炎的表情。这些实验为我们的工作做了如前所述在玉米(Chelius Triplett 2000 a, 2000 b)。
2.4。文化和收获的水稻、小麦、玉米和拟南芥的温室。大米和小麦线用于这项工作是栽培稻种虫害粳稻简历。Nipponbare和小麦l .简历。特伦顿。得到了不同生态型拟南芥的拟南芥生物资源中心(美国俄亥俄州立大学哥伦布,哦)。种子发芽和植物培养使用的协议拟南芥生物资源中心(http://aims.cse.msu.edu/ aimsweb / catalog97 / IV-A.html)。草是培养1:1砂:蛭石混合在两升塑料罐里。植物有一个营养解决方案,包含以下成分:5 (iM氯化钙,1.25 M ^ MgS04, 5 (iM KC1 1 ^ M KH2P04 0.162 | iM FeS04, 2.91 nM H3BO3 1.14 nM MnS04 0.76 nM ZnS04 0.13 nM NaMo04 0.14 nM NiCl2 0.013 nM C0CI2和0.19 nM CuS04。植物有补充照明。获得干重数据提出了这些植物,植物的地上部分放在纸袋在65°C和干重之前至少48小时。含氮量的小麦组织决心磨后组织威利轧机。氮浓度是衡量快速燃烧在850°C紧随其后所有N-combustion产品转换成N2和随后的热导率测量的电池(LECO模型fp - 528;LECO Corp .)、圣约瑟夫,密苏里州)。
2.5。16 s rDNA扩增和测序。16 s rRNA基因的PCR扩增和测序从草内生菌是如前所述(Chelius Triplett 2000 c)。加入数据的16 s rRNA基因k . 342年肺炎,Pantoea sp。P101 Pantoea sp。P102 AF394537, AF394538 AF394539,分别。
2.6。建设342年克雷伯氏菌peumoniae nifH插入突变。扩增和序列分析表明,nifH从342株肺炎从k . 88%序列身份nifH M5al。引物nifH如果(5‘-GCCTGCAGATGACC ATGCGTCAATGCGCC-3”)和nifH876r (5 -GCGAATTCCGCGTTTTCTTCGGCGGCGGT-3)设计基于k .肺炎的nifH序列M5al(加入基因库XI3303数量)。一百ng的菌株342 DNA作为模板在25 | il PCR混合物第九PCR缓冲(Promega)、核苷酸MgCl2 2.5毫米,0.2毫米和0.5 U的Taq。热循环条件4分钟在95°C的变性;30 94°C的周期30年代,54°C 30年代,72°C, 1分钟;然后在72°C扩展7分钟。PCR产品是使用试剂盒纯化PCR净化装备然后结扎pGEM-T容易向量(试剂盒)。白色的殖民地和质粒被孤立。ABI的循环测序工具使用的威斯康星麦迪逊大学生物技术中心两个质粒序列使用引物T7和Sp6。 As a result of this high identity, plasmid pSA30 containing nifHDKYE from K. peumoniae M5al (Brown, Ausubel 1984) was used to make the insertion and subsequent marker exchange. A 1.7 kb fragment containing nifH gene (882 bp) and part of nifD (632 bp) was excised from pSA30 by double digestion with EcoKl and BamHl. This fragment was inserted into EcoKI/BamHI doubly digested vector pUC18, resulting in plasmid pHl. A 1.4 kb fragment from pKJRPll (Reece, Phillips 1995) containing a kanamycin resistance gene downstream of a constitutive promoter was excised with Hindlll and then blunted with Klenow. Following Bglll digestion of pHl and subsequent blunting with Klenow, the fragment from pKRPll was inserted into the Bglll site of pHl. The BglII site in pHl was located in the middle of nifH gene. This new plasmid was named as pll. To exchange the inserted allele of nifH for the wild type allele on the K. pneumoniae 342 chromosome, the 3.1 kb fragment containing nifHD'-Km was excised from pll by double digestion with £coRI and Pstl, and EcoRl site was blunted. This fragment was ligated into the PstUSmal doubly digested suicide plasmid pJQ200KS+ and marker exchanged as described previously (Scupham, Triplett 1997). Nif isolates were confirmed by Southern hybridization with an nptH probe
3所示。结果与讨论
对植物生长的影响三个菌株孤立在这个实验室N-efficient行玉米或柳枝稷是这里描述。这些菌株比较,两个甘蔗固氮内生菌的菌株。这些压力往往增加玉米当N肥的生产力提供但他们不减轻N-deficiency条件的植物没有氮肥(里格斯et al . 2001年)。我们测试这些菌株对水稻和小麦的生长反应没有N和这些压力的增长效应a芥的固定N .小麦和水稻比玉米植株小得多,我们的希望是,这些菌株可能提供足够的固定N来缓解缺氮的小草不能观察到玉米(图1和图2)。
这里使用的菌株都松了一口气缺氮症状以来小麦N -„, _。„^,^
。,。图1所示。特伦顿春小麦生长plantmg后受精种植的植物,同时被六周。种子
注射更大的和更有活力。然而,342 K肺炎或342 nifti突变的蹒跚。
没有固定的N,增长,^ unmoculated控制也会显示。植物氮浓度和总N /植物培养m没有添加N。
未接种Kp342 Kp342nifH
菌株342 -接种植物明显高于N /植物(4.22毫克)比未经变质处理的植物(3.54 mg N /植物)以及那些植物接种nifll突变菌株342 (3.53 mg N /植物)。因此,这种增长增加N-starved小麦在接种菌株342可以归因于固氮作用的内生植物(图1),342是一个内生植物小麦(董、Triplett未发表)除了生存能力endophytically在玉米(Chelius,三重«2000 a, 2000 b)。
这些可以提高玉米植株增长与添加N(里格斯et al . 2001年),我们感兴趣的是这些反应的机制。我们决定是否这些菌株可以提高拟南芥的生长在固定n如果拟南芥是增加的大小,我们可以屏幕的拟南芥突变体那些不应对培养液。没有响应突变体将被用来识别宿主基因参与这个响应的身份应该给我们线索在响应中细菌的作用。我们已经找到几个指标的增长大大增加在这里使用与一个或更多的内生菌接种(图3),所以我们现在可以开始屏幕EMS Ws-2的突变体。Hormone-insensitive拟南芥的突变体也将被测试。
我们继续保持在柳枝稷的温室植物收集在1998年的秋天从遗迹Polver附近的草原,威斯康辛州。这些植物继续生长,尽管非常缓慢,自1998年11月,尽管没有固定的氮源。原生草生长在低氮条件下出现的丰富来源diazotrophic细菌可以提供固定N植物以及植物生长增加机制(s)独立于固氮。在未来的工作中,我们打算测试的能力diazotrophs收集从玉米和柳枝稷提供固定N 15 n2还原分析小麦和大米。
未接种P102K p342
图3。拟南芥的生长Ws-2接种后的柳枝稷隔离Pantoea sp。PI02肺炎或玉米隔离k . 342。一个未经变质处理的控制也会显示。植物培养与添加N。
未接种P102K p342
图3。拟南芥的生长Ws-2接种后的柳枝稷隔离Pantoea sp。PI02肺炎或玉米隔离k . 342。一个未经变质处理的控制也会显示。植物培养与添加N。
未接种P101
图2。增长的大米13周后接种与Pantoea sp P101。一个未经变质处理的控制也会显示。植物培养m没有添加N。
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