材料与方法

最后更新于2023年1月16日星期一|有机碳

通过将南极菌源性有机物与南极菌接种物混合进行再生实验。在fe -limit (LFe)和rich (HFe)条件下生长的P. antarctica的纯培养物制备了phaeocystis来源的有机物。

所有实验程序都是在Schoemann等人(2001)所描述的微量金属清洁条件下进行的。除了有机物取样，烧瓶和过滤设备用于棕囊藻培养，再生实验和海水取样采用聚碳酸酯或高密度聚乙烯。聚碳酸酯实验器皿浸泡在1n HCl中至少48小时，而更耐腐蚀的聚乙烯容器用7n HNO3去污。营养样品采集于1n盐酸酸清洗的聚乙烯小瓶中。实验室材料在使用前用超高纯水(milliq Element系统，Millipore)彻底冲洗。孵育前和取样期间的所有程序都在100级层流实验台上进行。用于有机碳取样和测量的材料是玻璃或特氟龙，并通过灰化(550°C下4小时)或用铬硫酸(Merck)或浓缩6n HCl清洗仔细清洗。

棕囊藻属文化但是此属

棕囊藻属南极洲但是此属株CCMP1871，原产于别林斯高晋海海来自美国普罗瓦索里-吉拉德国家海洋浮游植物培养中心(CCMP, USA)。在天然(低铁，高常量营养素)南极海水中进行培养，不添加任何人工螯合剂(如乙二胺四乙酸，EDTA)，以保持铁的各种天然化学形式的平衡和动力学(Gerringa等人，2000年)。海水在0.2 mm孔隙的Sartobran滤筒上过滤，并通过y辐射消毒。Phaeocystis antarctica在LFe (<1 nM)和HFe (raybet雷竞技最新+2 nM)海水中生长和驯化了至少五代。培养温度为2℃，昼夜循环为16:8 h

180摩尔量子m-2 s_1。将分别适应LFe和HFe条件的P. antarctica接种物(15 ml)加入20 l LFe和HFe南极海水中。南极表面海水是在西南太平洋收集的南冰洋在2001年12月CLIVAR SR3巡航期间(135°E-150°E)。对于HFe条件，南极海水在开始培养前72小时富集2 nM FeCl3。8天后，培养物中再加入2 nM FeCl3。总共4 nM Fe分两次加入，以防止加入的Fe直接析出，确保批培养中Fe的浓度为>2 nM。15 d后，在指数生长阶段采集样品进行再生长实验，测定养分、Chl a、P. antarctica细胞数、单细胞和菌落生物量、颗粒有机碳(POC)、颗粒氮(PON)和DOC。

细菌培养

细菌接种物是在麦克默多海峡(南极洲)实验前4个月收集的0.8毫米预过滤南极海水中制备的。这些细菌在LFe (<1 nM)和HFe (+2 nM)南极海水中预培养至少5代。它们是在2°C的黑暗环境中生长的。

再生实验

从指数生长的LFe和HFe P. antarctica中制备了两个有机质池:(i)溶解有机质(DOM)，通过0.1 mm聚碳酸酯核孔过滤器(nucleic -pore filter)温和过滤(<0.3 atm)获得，(ii)总有机质(TOM)，未过滤，包括浮游植物裂解后通过声波处理(22 W声波10分钟，脉冲0.2 s/s)和冷冻/解冻(-80℃深冷冻/60℃水浴循环，重复三次)方法获得的DOM和POM。通过荧光显微镜观察破碎的细胞，证明了该方法的有效性。

细菌以1:10的体积比接种每种制备好的有机物质培养基(2 l)。然后将Bioas-says在2℃的黑暗中培养约30天。收集子样本以监测细菌丰度、生物量、遗传多样性、5-氰基-2,3-二丁基四唑氯化铵(CTC)阳性细胞、外酶活性、产量和有机碳利用的时间演化。

分析方法

营养物质

根据Koroleff (1983a, b)测定硝酸盐和磷酸盐浓度。铁样品在0.1 mm Nuclepore聚碳酸酯膜上过滤，并用超清洁石英蒸馏浓硝酸酸化至pH < 2 (Ultrex, JT Baker)。根据Obata等人(1993)采用的化学发光方法测定溶解铁浓度，并应用于Sarthou等人(2003)。毛坯平均为0.06±0.02 nM。检测限为0.03±0.01 nM。

叶绿素a和南极Phaeocystis生物量

采用Yentsch和Menzel(1963年)对0.8 mm Nuclepore聚碳酸酯膜过滤器上保留的颗粒材料进行4℃、90% v/v丙酮萃取(12小时)后，用荧光法测定Chl a。方法的相对标准偏差均优于2%。

测定南极磷生物量的样品用戊二醛(终浓度0.5%)保存游离活细胞，用葡二醛-卢戈尔溶液(终浓度1%)保存菌落。4'-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后，用荧光显微镜(400倍放大)计数游离细胞(Porter and Feig 1980)。根据Utermohl(1958)的方法，用倒置光学显微镜(100倍放大)枚举菌落。菌落和细胞生物量根据Mathot et al.(2000)估算。

有机碳

对于浮游植物颗粒有机碳(POC)和颗粒氮(PON)的测定，有一些悬浮物在预燃(450°C) Whatman GF/F过滤器中收集，在60°C下干燥，并储存在聚苯乙烯培养皿中，直到分析。用Carlo Erba NA 2000元素分析仪分析POC和PON。POC的分析误差为±0.8 mM, PON的分析误差为±0.04 mM N。

溶解样品(DOC)和总有机碳(TOC)储存在玻璃管中，叠氮化物(最终浓度0.5%)中毒，并用聚四氟乙烯内衬螺旋盖密封。在4°C的黑暗环境中进行分析。采用高温催化氧化法(HTCO;Sugimura和Suzuki 1988)， Dohrmann Apollo 9000分析仪。碳浓度的测定采用五点校准曲线，该标准通过在超纯水中稀释邻苯二甲酸钾原液(milliq Element系统，Millipore)制备。每个值对应于至少5个注入的平均值。样品一式两份，相对标准偏差不超过2%。我们的DOC测量的准确性是通过Hansell实验室(迈阿密大学)提供的测量参考物质进行测试的。我们得到深海参考物质(马尾藻深海水，2600米)的平均浓度为45.1±0.7 mM C (n = 10)，低碳参考水的平均浓度为1.4±0.7 mM C (n = 10)。我们的数值在参考实验室提供的标称值范围内(分别为44.0±1.5和2.0±1.5 mM C)。

细菌生物量和活性

用于细菌分析的样品用40%缓冲甲醛保存(最终浓度为2%)。根据Porter和Feig(1980)，细菌通过直径为25毫米的0.2毫米黑色Nuclepore聚碳酸酯过滤器过滤，并用4'-6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI，最终浓度为2.5 mg ml-1)染色。至少1000个细胞用徕卡荧光显微镜在至少10个不同的视野下以1000倍放大倍数进行计数。细菌丰度测定的相对标准偏差估计为15% (n = 20)。通过图像分析(Lucia 4.6软件)确定细菌的生物量，并将杆和球菌分别视为圆柱体和球体来计算(Watson et al. 1977)。通过使用Simon和Azam(1989)测量的数据建立的关系，将它们转换为碳生物量:

C = 0.12 V0'72，其中C为每个细胞的碳(pg C mm-3)， V为生物体积(mm3)。

5-氰基-2,3-二丁基四唑氯化铵(CTC)还原菌的数量通过最终浓度为2.5 mM并在2℃下孵育2小时来确定(Rodriguez等，1992年)。用40%缓冲甲醛(终浓度2%)停止反应。样品进一步过滤，DAPI染色，如上所述进行观察。

在饱和浓度(40 mM l-亮氨酸-7-氨基-4-甲基-香豆素-香豆素外蛋白酶活性溶液(EPA)和6 mM 4-甲基伞形花序-b- d -葡萄糖苷溶液)下，用荧光法(Kontron SFM 25荧光计)测定模型底物的最大水解速率(Hm)。7-氨基-4-甲基coumarine (MCA)激发波长为360 nm，发射波长为445 nm, 4-甲基伞形酮(MUF)激发波长为365 nm，发射波长为455 nm。在2°C的黑暗环境中，测量样品中的荧光随时间超过60分钟的变化。荧光单位随时间的增加由反应最终产物(EPA为7-氨基-4-甲基coum-arin (Sigma)， EGA为4-甲基伞形酮(Sigma))制备的标准曲线转化为活性。氨基肽酶和葡萄糖苷酶活性的相对标准偏差分别为12% (n = 20)和11% (n = 20)。

通过加入3h -胸苷来估计细菌产量(Fuhrman和Azam 1982)。重复的10 ml子样品在2°C的黑暗环境中，在20nm的3h -胸腺嘧啶(Amersham;40-50 Ci moP1)， 0.2 p过滤。m醋酸纤维素膜过滤器(Sarto-rius)，用5%三氯乙酸(TCA)冰萃取(Becquevort和Smith 2001年)。利用Ducklow等人(1999)为罗斯海细菌群落建立的转换因子将胸苷结合转化为细菌生产(即每摩尔纳入冷TCA不溶性材料的胸苷产生8.6 X 10 7个细菌)。对于细菌产量，相对标准偏差为9.3% (n = 20)。具体生长速率由细菌产量和细菌生物量来估计。

细菌生长效率(BGE)，即浮游细菌将OC转化为细菌生物量的效率，由底物的下降速率(OC)和细菌产量的增长速率(BB)计算得出，如下所示:

基于此方程，我们从模型II回归中通过ABB与-AOC的性质-性质线性回归推导出BGE，当P < 0.05时，可以确定BGE为显著性。

采用聚合酶链式反应(PCR)扩增16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术，分别在0、6和30 d进行遗传多样性的检测。采用341F-GC/907R引物，按照Schafer和Muizer(2001)的方法进行DNA提取和PCR-DGGE。DGGE指纹经图像分析(DOC-PRINT, Proxylab)处理。通过简单的匹配距离计算凝胶上的通道之间的距离，并使用SYSTAT Package (V.11, SPSS)[欧氏距离和无权对组法与算术平均(UPGMA)]进行聚类分析。

统计分析

我们采用无重复的三向变异分析(ANOVA)分析，测试了铁富集(LFe和HFe)、有机质分馏(DOM和TOM)以及培养时间对所测各项参数的独立和交互影响。对数据进行正态分布和方差相等的初步检验，以验证方差分析假设。当这些条件不满足时，就对数据进行日志转换。所有统计分析均采用SYSTAT软件包(V.11, SPSS)进行，显著性水平为0.05。采用sigmapplot (V.7, SPSS)进行最小二乘回归拟合，以确定OC是否随时间变化。对不同处理之间的外酶活性和细菌生长速率进行Pearson相关性分析，以确定这些变量之间是否存在线性关系。

结果

LFe和HFe Phaeocystis培养物的特征

在再生长实验的次采样时，LFe培养中溶解的Fe浓度为0.85 nM, HFe培养中溶解的Fe浓度为2.76 nM。LFe中Chl a细胞含量较低(LFe为0.05 pg Chl a cell-1, HFe为0.24 pg Chl a cell-1)，反映了LFe中Phaeocystis细胞的铁胁迫(表1)。在LFe培养中，81%的浮游植物生物量由Phaeocystis单细胞组成，而在HFe培养中，Phaeocystis菌落占总生物量的68%。Phaeocystis菌落黏液碳仅占浮游植物总碳的很小一部分，HFe生物测定中仅占碳的2.3%。在LFe条件下，黏液对浮游植物总碳的贡献更低(0.3%)。在后者中，观察到的菌落通常由两个嵌入粘液基质的细胞组成。

在HFe培养中POC和PON浓度较高，但POC和PON的增加不成正比(表1)。这导致对比C:N摩尔比，在LFe培养中记录的最高值(8.3)与HFe培养(5.0)相比。LFe培养的DOC高于HFe培养。在南极海水中(Phaeocystis接种前)最初的DOC为107 mM，因此在浮游植物生长过程中新鲜产生的DOC (DOCfresh)，在LFe培养中为73 mM，在HFe中为22 pm

表1用于细菌再生实验的低铁(<1 nM Fe, LFe)和铁修正(HFe)条件下P. antarctica培养物中Fe浓度、每个细胞Chl a、P. antarctica细胞丰度、颗粒有机碳(POC)、颗粒有机氮(PON)和溶解有机碳(DOC)

参数	纤维变性	HFe
溶解铁(nM)

继续阅读:两种Phaeocystis种Prymnesiophyceae的定植被pennate硅藻和其他原生生物的殖民地生物量的重要贡献

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